欢迎来到日新科技-来自韩国的微射流纳米制剂专家官网!

日新科技-来自韩国的微射流纳米制剂专家

全国服务热线 13611679056

联系我们

公司名称:日新科技-来自韩国的微射流纳米制剂专家

联系人:朱小姐

电话:13611679056

手机:13611679056

地址:苏州昆山市晨淞路128-1号

制备DLIN-MC3脂质纳米颗粒

发表时间:2022-03-29 17:50:19   浏览量:35

制备DLIN-MC3脂质纳米颗粒

  实验目的:

  分别以DLIN-MC3为阳离子主要脂质,参照文献方法制备包载mRNA的LNP。


  实验原理:

  DLIN-MC3是可解离脂质,在酸性条件下可质子化形成阳离子脂质,通过静电作用于带负电的mRNA结合,形成载有mRNA的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles,LNPs)。常见的制备方法有薄膜-水化法、溶剂注入法、高压均质法和微流控法等方法,在本实验中采用微流控法,让脂质溶液与和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的混合,形成粒径均一的LNP。由于脂质溶解于乙醇中,核酸溶解于酸性缓冲液中,因此需要透析去除残余的乙醇并换液至PBS。


  实验材料:

  DLIN-MC3、DSPC、DMG-PEG2000、冰醋酸、三水醋酸钠


  实验步骤:

  1、 配置脂质乙醇溶液:

    a) LNP 的成分与分子量见下表:

名称

摩尔比%

分子量

质量

DLIN-MC3

50

642.09

130mg

DSPC

10

790.2

33mg

PEG-2000

1.5

2509.2

16mg

CHO

38.5

386.654

62mg

无水乙醇(AR)

100ml


  百分比来源于前期研究,并不一定与 onpattro 和 mRNA-1273 相同。


    b)每种成分别配置三个浓度:8 mM(约5 mg/ml)、12 mM(约7.5 mg/ml)和16 mM(约10 mg/ml)。

名称

重量或体积

冰醋酸

8ml

三水醋酸钠

3.2g

纯化水

1000ml


  2、 计算 mRNA 浓度:

    a) 根据 N/P=6,FRR=3 计算所需 RNA 浓度。

    b) RNA 的碱基的平均分子量为340,每个碱基携带1 个磷酸,因此RNA 中的含磷量为3.1 nmol/μg.

    c) 计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数,因此每摩尔混合脂质中含有 0.5 摩尔 N。

脂质浓度(mM)

8

12

16

N/P

6

6

6

FRR

3

3

3

RNA 浓度(μg/ul)

 

0.072

 

0.108

 

0.143


  3、 配置 mRNA-醋酸缓冲液:

    称取3.2g三水醋酸钠,8ml冰醋酸,定容于1000ml。加入相应梯度的mRNA

  4、 微流控混合:

 

    a. 将脂质-乙醇溶液过 0.22 μm 疏水聚四氟乙烯膜,mRNA-柠檬酸缓冲液过 0.22 μm 亲水聚四氟乙烯膜,过膜后装入微量注射器中。

 

    b. 以FRR=3 ,磷脂和缓冲液以0.2ml/min和0.6ml/min,通过nexstarnano1芯片,混合。

 

  5、 透析与储存:

    a) 制备后放入透析管(Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL)中加入 14 ml PBS在摇床上透析,2 小时后换液,直至 18 小时后透析结束。

    b) 保存于 4℃待用。


实验名称:LNP 包封率测定

  实验目的:

    对制备的 LNP 包封 mRNA 的效果进行测定

 

  实验原理:

    Quant-iT™RiboGreen®RNA 试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂,可检测溶液中 1-200 ng 的核酸,这种核酸染料无法透过 LNP,因此只有游离的未被 LNP 包载的核酸可以被结合。Triton-100 作为一种表面活性剂常被用做破乳剂,使用 1%的 Triton-100 处理获得的 LNP-mRNA 可以使包载的核酸释放,得到总核酸量。通过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量,再除以总核酸量即可得到包封率,即:

包封率(%)=(破乳后定量-破乳前定量)/破乳后定量

 

  实验材料:

    Quant-iT ™ RiboGreen ™ RNA   检 测 试 剂 盒 ( Thermo  Fisher , R11490 )、 Triton ™ X-100

    (SIGMA-ALDRICH,T8787-100ML)、DEPC 水、CellCarrier-96 Ultra Microplates  ( PerkinElmer,6055308)、 LNP-mRNA


  实验步骤:

    1. LNP 制备:

      见 LNP 制备流程。

    2. 试剂准备(详细参见说明书):

      将 20xTE 用 DEPC 水稀释至 1x;

      用稀释好的 1XTE 稀释试剂盒中的标准品,稀释成 2 μg/mL 及 100 ng/mL 两种终浓度;

      用 1xTE 稀释试剂盒中的 QuantiT™ RiboGreen® Reagen,稀释成 200 倍及 2000 倍两种终浓度; 按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下试剂,做复孔:


High range

Low range


1. LNP 破乳

Triton-100 1xTE 稀释到 2%,取 100 μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates,加入 1 μl 制备好的

LNP,处理 5 分钟,加入 100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent

 

2. LNP 游离核酸测定

CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100ul1xTE,取 1μl 制备好的 LNP 加进去,混匀,加入 100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent

 

3. 读板

使用 SPARK 读取荧光强度,激发光设置为 480 nm,发射光为 520 nm

 

4. 数据处理

1 标曲制备

High range

Low range

2) 样品定量

载药量=破乳后读值-破乳前读值包封率(%=载药量/破乳后读值


返回顶部