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新冠疫苗中mRNA成分和LNP递送系统的功能和特征及其对疫苗稳定性影响

发表时间:2022-03-23 11:23:55   浏览量:28

mRNA疫苗概述

 

mRNA-LNP 疫苗的组成是其稳定性的基础。在针对新冠病毒的疫苗开发过程中,已经有多种不同的 mRNA 候选疫苗。目前,有10种不同的针对新冠的mRNA疫苗已进入临床试验,包括常规 mRNA疫苗和自扩增 mRNA (SAM)。目前有三种“常规”可编码完整的S蛋白的mRNA 疫苗已获批或处于临床试验后期。它们是 Moderna 的 mRNA-1273 疫苗、BioNTech/Pfizer 的 BNT162b2/Comirnaty 和 CureVac 的 CVnCoV(可见表1)。

 

有几篇综述对这三种新冠的 mRNA疫苗进行了详细比较,包括它们在 mRNA 结构和LNP设计方面的差异和相似之处。以下部分旨在概述这些疫苗中mRNA 成分和 LNP递送系统的功能和特征,因为它们对 mRNA 疫苗的体内给药和储存期间的稳定性起着关键作用。

图片3.png 

表1  有关目前上市使用或临床 III 期试验的三种 mRNA-LNP疫苗的信息,出于比较原因,添加了 Onpattro(一种 siRNA-LNP 药物产品)的药物产品信息。

 

 

* NDA 210922 ONPATTRO (patisiran) 脂质复合物注射液;药品质量审查附录(FDA,2017 年)。

a N = 可电离的阳离子脂质(氮),P = 核苷酸(磷酸盐)。

b推测

 

 2.1 优化mRNA体内稳定性和翻译能力的mRNA工程

 

 mRNA由于其磷酸基团上带有负电荷,在生理 pH 范围内是以聚阴离子大分子的形式存在。递送mRNA 疫苗的第一个障碍是由于核糖核酸酶在细胞外环境中含量丰富,裸露的mRNA在注射后容易被核糖核酸酶 (RNase) 迅速降解。其次, mRNA进入细胞会被细胞内RNA受体识别,包括内体Toll 样受体 (TLR) 和细胞质核酸受体。mRNA与这些宿主防御受体的结合会激活先天免疫通路,会导致数百个基因的表达。一方面,这可以为疫苗提供佐剂样作用。另一方面,它导致细胞处于抗病毒状态,这强烈降低了细胞内mRNA的稳定性和翻译表达。摄取进入细胞后, mRNA 链需要与核糖体结合以实现所编码蛋白质的翻译表达。可以通过mRNA工程显著改善mRNA 的蛋白质合成速率和功能半衰期,mRNA疫苗中的mRNA链的典型元件示意图如图1所示。

图片4.png 

图1 体外转录 (IVT) mRNA 的结构元件。这些序列中的每一个部分都可以优化和修改,以调节mRNA 的稳定性、翻译能力和免疫激活能力。

 

 有很多研究尝试提高mRNA 分子的体内稳定性和翻译能力,同时避免不需要的先天免疫激活。目前达成共识的是,这可以通过优化 mRNA 的调控区域5' 帽、poly-A 尾和非翻译区 (UTR)来实现。UTR位于mRNA 编码区的两侧,可以调节mRNA的稳定性和翻译。

 

poly-A尾也能调节mRNA的稳定性,因为它的缩短和去除都会导致 mRNA 的降解。5' 帽结构对于蛋白质生产和翻译启动子的结合很重要。此外,具有最大化 GC(鸟嘌呤-胞嘧啶)含量的mRNA 结合密码子优化,即在编码区选择“常用密码子”,可提高稳定性和翻译水平。

 

 

 

另一个关键因素是mRNA的二级结构,它可以通过密码子优化和计算工具来改变一级序列使其稳定。通过选择“高度结构化的编码序列”在mRNA中构建二级结构 (除了5' UTR 区域)也会产生更高的体内翻译水平,因为mRNA体内半衰期得到延长。或者,Mauger等人证明天然存在的修饰尿苷的引入,例如使用1-甲基-假尿苷(m1Ψ)代替尿苷,会带来mRNA二级结构的整体变化,从而达到更高水平的蛋白质表达。

 

重要的是,目前将RNA结合蛋白对mRNA的胞内识别降至最低的最有效方法是在mRNA中引入这些修饰的尿苷,这些蛋白参与对外来mRNA的先天免疫反应,反过来增强了生物稳定性和翻译能力,同时降低了mRNA 疫苗的免疫原性。此外,还有迹象表明,m1Ψ 提高了mRNA 的碱基堆积和熔点,从而使mRNA更加稳定。

 

这可能意味着 Moderna 和 BioNTech/Pfizer 的新冠疫苗,1mΨ的掺入也会提高给药前mRNA 的稳定性。最近有文章发表了对 CureVac在 CVnCoV mRNA 工程中所做工作的有趣分析,CureVac 采用了不同的策略。然而,即使优化了mRNA的结构,直接注射裸露的mRNA 也不会引起强烈的免疫反应,这可能是因为裸露的mRNA的细胞转染能力差和对RNA酶(RNase)敏感。这说明仅优化mRNA结构不足以创建有效的 mRNA 疫苗,仍然需要额外的保护和递送系统。

 

另一种类型的 mRNA 疫苗SAMs不仅编码目标抗原,还编码RNA 聚合酶——来自病毒的“自我放大”因子。通常,SAMs由 9 kb 的mRNA核苷酸组成,而非自我复制的mRNA疫苗的序列长度仅为2-4 kb。开发 SAM 候选疫苗的目的是替代典型的两剂策略的“启动-加强”方案,而是达到每位接种者单次注射。由于自带的复制能力,SAM疫苗的注射剂量低于传统mRNA疫苗,一剂便可能达到足够保护效力。

 

当 SAM 在宿主细胞中被翻译时,一种RNA聚合酶合成与编码mRNA 模板互补的反义RNA中间体,再转录为许多编码mRNA 分子,从而使抗原表达延长和增强。目前两种 SAM 疫苗都编码完整的S 蛋白,并且这些疫苗在临床试验中的最高剂量比常规mRNA 疫苗的典型剂量低十倍以上。临床开发中的两种SAM 疫苗是伦敦帝国理工学院的nCoVsaRNA 和 Arcturus/Duke-NUS 的 ARCT-021,两种疫苗均采用的是LNP包裹技术。


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