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NEXSTAR微流控制备仪LNP包裹方案

发表时间:2022-04-01 11:34:04   浏览量:50

制备DLIN-MC3脂质纳米颗粒

 

实验目的:

分别以DLIN-MC3为阳离子主要脂质,参照文献方法制备包载 mRNA  LNP

 

实验原理:

DLIN-MC3是可解离脂质,在酸性条件下可质子化形成阳离子脂质,通过静电作用于带负电的 mRNA  结合,形成载有 mRNA 的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs) 。常见的制备方法有薄膜-水化法、 溶剂注 入法、 高压均质法和微流控法等方法, 在本实验中采用微流控法, 让脂质溶液与和 mRNA 溶液在微混合器中充 分、迅速的混合,形成粒径均一的 LNP 。由于脂质溶解于乙醇中,核酸溶解于酸性缓冲液中,因此需要透 析去除残余的乙醇并换液至 PBS

 

实验材料:

DLIN-MC3 DSPC DMG-PEG2000 、冰醋酸、三水醋酸钠

实验步骤:

1  配置脂质乙醇溶液:

a)     LNP 的成分与分子量见下表:

名称

摩尔比%

分子量

质量

DLIN-MC3

50

642.09

130mg

DSPC

10

790.2

33mg

PEG-2000

1.5

2509.2

16mg

CHO

38.5

386.654

62mg

无水乙醇(AR)

100ml

百分比来源于前期研究,并不一定与 onpattro  mRNA-1273 相同。

b)每种成分别配置三个浓度: 8 mM(约5 mg/ml) 12 mM(约7.5 mg/ml) 16 mM(约10 mg/ml) 

 

名称

重量或体积

冰醋酸

8ml

三水醋酸钠

3.2g

纯化水

1000ml

2、 计算 mRNA 浓度:

a)     根据 N/P=6,FRR=3 计算所需 RNA 浓度。

b)     RNA 的碱基的平均分子量为340,每个碱基携带1 个磷酸, 因此RNA 中的含磷量为3.1 nmol/ μg.

c)     计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数,因此每摩尔混合脂质中含有 0.5 摩尔 N。

 

脂质浓度(mM)

8

12

16

N/P

6

6

6

FRR

3

3

3

RNA 浓度(μg/ul)

0.072

0.108

0.143

3  配置 mRNA-醋酸缓冲液:

称取3.2g三水醋酸钠,8ml冰醋酸,定容于1000ml 。加入相应梯度的mRNA

4  微流控混合:

 

a.     将脂质- 乙醇溶液过 0.22 μm 疏水聚四氟乙烯膜,mRNA-柠檬酸缓冲液过 0.22 μm 亲水聚四氟 乙烯膜,过膜后装入微量注射器中。

 

b.      FRR=3 ,磷脂和缓冲液以0 . 2ml/min0 .6ml/min ,通过nexstarnano1芯片,混合。

 

5  透析与储存:

a)     制备后放入透析管(Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL)中加入 14 ml PBS 在摇床上透析,2 小时后换液,直至 18 小时后透析结束。

b)     保存于 4℃待用。

 

图片1.png

实验名称: LNP 包封率测定

 

 

 

实验目的:

对制备的 LNP 包封 mRNA 的效果进行测定

 

实验原理:

Quant-iTRiboGreen®RNA 试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂,可检测溶液中 1-200 ng 的核酸,这种 核酸染料无法透过 LNP,因此只有游离的未被 LNP 包载的核酸可以被结合。Triton-100 作为一种表面活性剂 常被用做破乳剂,使用 1% Triton-100 处理获得的 LNP-mRNA 可以使包载的核酸释放,得到总核酸量。通 过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量,再除以总核酸量即可得到包封率,即:

包封率(%=(破乳后定量-破乳前定量) /破乳后定量

 

 


实验材料:

Quant-iT   RiboGreen ™   SIGMA-ALDRICH T8787-100ML)、

LNP-mRNA


 

RNA         Thermo  Fisher  R11490 )、 Triton   X-100

DEPC 水、CellCarrier-96 Ultra Microplates     PerkinElmer 6055308)、


 

实验步骤:

1.  LNP 制备:

 LNP 制备流程。

2.  试剂准备(详细参见说明书):

 20xTE  DEPC 水稀释至 1x

用稀释好的 1XTE 稀释试剂盒中的标准品,稀释成 2 μg/mL  100 ng/mL 两种终浓度;

 1xTE 稀释试剂盒中的 QuantiT RiboGreen® Reagen ,稀释成 200 倍及 2000 倍两种终浓度; 按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下试剂,做复孔:

High range

image.png

image.png

3.  LNP 破乳

 Triton-100  1xTE 稀释到 2% ,取 100 μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates ,加入 1 μl 制备好的

LNP ,处理 5 分钟,加入 100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent

 

4.  LNP 游离核酸测定

 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100ul1xTE,取 1μl 制备好的 LNP 加进去,混匀,加入 100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent

5.  读板

使用 SPARK 读取荧光强度,激发光设置为 480 nm ,发射光为 520 nm


6.  数据处理

1 标曲制备

图片2.png









图片3.png

2) 样品定量

载药量=破乳后读值-破乳前读值  包封率(%=载药量/破乳后读值


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