制备DLIN-MC3脂质纳米颗粒

实验目的：

分别以DLIN-MC3为阳离子主要脂质，参照文献方法制备包载 mRNA 的 LNP。

实验原理：

DLIN-MC3是可解离脂质，在酸性条件下可质子化形成阳离子脂质，通过静电作用于带负电的 mRNA  结合，形成载有 mRNA 的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs) 。常见的制备方法有薄膜-水化法、 溶剂注 入法、 高压均质法和微流控法等方法， 在本实验中采用微流控法， 让脂质溶液与和 mRNA 溶液在微混合器中充 分、迅速的混合，形成粒径均一的 LNP 。由于脂质溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性缓冲液中，因此需要透 析去除残余的乙醇并换液至 PBS。

实验材料：

DLIN-MC3 、DSPC 、DMG-PEG2000 、冰醋酸、三水醋酸钠

实验步骤：

1 、 配置脂质乙醇溶液：

a)     LNP 的成分与分子量见下表：

百分比来源于前期研究，并不一定与 onpattro 和 mRNA-1273 相同。

b)每种成分别配置三个浓度： 8 mM（约5 mg/ml） 、12 mM（约7.5 mg/ml） 和16 mM（约10 mg/ml） 。

2、 计算 mRNA 浓度：

a)     根据 N/P=6，FRR=3 计算所需 RNA 浓度。

b)     RNA 的碱基的平均分子量为340，每个碱基携带1 个磷酸， 因此RNA 中的含磷量为3.1 nmol/ μg.

c)     计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数，因此每摩尔混合脂质中含有 0.5 摩尔 N。

3 、 配置 mRNA-醋酸缓冲液：

称取3.2g三水醋酸钠，8ml冰醋酸，定容于1000ml 。加入相应梯度的mRNA

4 、 微流控混合：

a.     将脂质- 乙醇溶液过 0.22 μm 疏水聚四氟乙烯膜，mRNA-柠檬酸缓冲液过 0.22 μm 亲水聚四氟 乙烯膜，过膜后装入微量注射器中。

b.      以FRR=3 ，磷脂和缓冲液以0 . 2ml/min和0 .6ml/min ，通过nexstarnano1芯片，混合。

5 、 透析与储存：

a)     制备后放入透析管（Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL）中加入 14 ml PBS 在摇床上透析，2 小时后换液，直至 18 小时后透析结束。

b)     保存于 4℃待用。

实验名称： LNP 包封率测定

实验目的：

对制备的 LNP 包封 mRNA 的效果进行测定

实验原理：

Quant-iT™RiboGreen®RNA 试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂，可检测溶液中 1-200 ng 的核酸，这种 核酸染料无法透过 LNP，因此只有游离的未被 LNP 包载的核酸可以被结合。Triton-100 作为一种表面活性剂 常被用做破乳剂，使用 1%的 Triton-100 处理获得的 LNP-mRNA 可以使包载的核酸释放，得到总核酸量。通 过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量，再除以总核酸量即可得到包封率，即：

包封率（%）=（破乳后定量-破乳前定量） /破乳后定量

实验材料：

Quant-iT ™  RiboGreen ™   （SIGMA-ALDRICH ，T8787-100ML）、

LNP-mRNA

RNA   检 测 试 剂 盒 （ Thermo  Fisher ， R11490 ）、 Triton ™  X-100

DEPC 水、CellCarrier-96 Ultra Microplates  （   PerkinElmer ，6055308）、

实验步骤：

1.  LNP 制备：

见 LNP 制备流程。

2.  试剂准备（详细参见说明书）：

将 20xTE 用 DEPC 水稀释至 1x；

用稀释好的 1XTE 稀释试剂盒中的标准品，稀释成 2 μg/mL 及 100 ng/mL 两种终浓度；

用 1xTE 稀释试剂盒中的 QuantiT™ RiboGreen® Reagen ，稀释成 200 倍及 2000 倍两种终浓度； 按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下试剂，做复孔：

High range

3.  LNP 破乳

将 Triton-100 用 1xTE 稀释到 2% ，取 100 μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates ，加入 1 μl 制备好的

LNP ，处理 5 分钟，加入 100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

4.  LNP 游离核酸测定

在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100ul1xTE，取 1μl 制备好的 LNP 加进去，混匀，加入 100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

5.  读板

使用 SPARK 读取荧光强度，激发光设置为 480 nm ，发射光为 520 nm

6.  数据处理

1） 标曲制备

2) 样品定量

载药量=破乳后读值-破乳前读值  包封率（%）=载药量/破乳后读值