公司名称:日新科技-来自韩国的微射流纳米制剂专家
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制备DLIN-MC3脂质纳米颗粒
实验目的:
分别以DLIN-MC3为阳离子主要脂质,参照文献方法制备包载 mRNA 的 LNP。
实验原理:
DLIN-MC3是可解离脂质,在酸性条件下可质子化形成阳离子脂质,通过静电作用于带负电的 mRNA 结合,形成载有 mRNA 的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs) 。常见的制备方法有薄膜-水化法、 溶剂注 入法、 高压均质法和微流控法等方法, 在本实验中采用微流控法, 让脂质溶液与和 mRNA 溶液在微混合器中充 分、迅速的混合,形成粒径均一的 LNP 。由于脂质溶解于乙醇中,核酸溶解于酸性缓冲液中,因此需要透 析去除残余的乙醇并换液至 PBS。
实验材料:
DLIN-MC3 、DSPC 、DMG-PEG2000 、冰醋酸、三水醋酸钠
实验步骤:
1 、 配置脂质乙醇溶液:
a) LNP 的成分与分子量见下表:
名称 | 摩尔比% | 分子量 | 质量 |
DLIN-MC3 | 50 | 642.09 | 130mg |
DSPC | 10 | 790.2 | 33mg |
PEG-2000 | 1.5 | 2509.2 | 16mg |
CHO | 38.5 | 386.654 | 62mg |
无水乙醇(AR) | 100ml |
百分比来源于前期研究,并不一定与 onpattro 和 mRNA-1273 相同。
b)每种成分别配置三个浓度: 8 mM(约5 mg/ml) 、12 mM(约7.5 mg/ml) 和16 mM(约10 mg/ml) 。
名称 | 重量或体积 |
冰醋酸 | 8ml |
三水醋酸钠 | 3.2g |
纯化水 | 1000ml |
2、 计算 mRNA 浓度:
a) 根据 N/P=6,FRR=3 计算所需 RNA 浓度。
b) RNA 的碱基的平均分子量为340,每个碱基携带1 个磷酸, 因此RNA 中的含磷量为3.1 nmol/ μg.
c) 计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数,因此每摩尔混合脂质中含有 0.5 摩尔 N。
脂质浓度(mM) | 8 | 12 | 16 |
N/P | 6 | 6 | 6 |
FRR | 3 | 3 | 3 |
RNA 浓度(μg/ul) | 0.072 | 0.108 | 0.143 |
3 、 配置 mRNA-醋酸缓冲液:
称取3.2g三水醋酸钠,8ml冰醋酸,定容于1000ml 。加入相应梯度的mRNA
4 、 微流控混合:
a. 将脂质- 乙醇溶液过 0.22 μm 疏水聚四氟乙烯膜,mRNA-柠檬酸缓冲液过 0.22 μm 亲水聚四氟 乙烯膜,过膜后装入微量注射器中。
b. 以FRR=3 ,磷脂和缓冲液以0 . 2ml/min和0 .6ml/min ,通过nexstarnano1芯片,混合。
5 、 透析与储存:
a) 制备后放入透析管(Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL)中加入 14 ml PBS 在摇床上透析,2 小时后换液,直至 18 小时后透析结束。
b) 保存于 4℃待用。
实验名称: LNP 包封率测定
实验目的:
对制备的 LNP 包封 mRNA 的效果进行测定
实验原理:
Quant-iT™RiboGreen®RNA 试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂,可检测溶液中 1-200 ng 的核酸,这种 核酸染料无法透过 LNP,因此只有游离的未被 LNP 包载的核酸可以被结合。Triton-100 作为一种表面活性剂 常被用做破乳剂,使用 1%的 Triton-100 处理获得的 LNP-mRNA 可以使包载的核酸释放,得到总核酸量。通 过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量,再除以总核酸量即可得到包封率,即:
包封率(%)=(破乳后定量-破乳前定量) /破乳后定量
实验材料:
Quant-iT ™ RiboGreen ™ (SIGMA-ALDRICH ,T8787-100ML)、
LNP-mRNA
RNA 检 测 试 剂 盒 ( Thermo Fisher , R11490 )、 Triton ™ X-100
DEPC 水、CellCarrier-96 Ultra Microplates ( PerkinElmer ,6055308)、
实验步骤:
1. LNP 制备:
见 LNP 制备流程。
2. 试剂准备(详细参见说明书):
将 20xTE 用 DEPC 水稀释至 1x;
用稀释好的 1XTE 稀释试剂盒中的标准品,稀释成 2 μg/mL 及 100 ng/mL 两种终浓度;
用 1xTE 稀释试剂盒中的 QuantiT™ RiboGreen® Reagen ,稀释成 200 倍及 2000 倍两种终浓度; 按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下试剂,做复孔:
High range
3. LNP 破乳
将 Triton-100 用 1xTE 稀释到 2% ,取 100 μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates ,加入 1 μl 制备好的
LNP ,处理 5 分钟,加入 100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。
4. LNP 游离核酸测定
在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100ul1xTE,取 1μl 制备好的 LNP 加进去,混匀,加入 100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。
5. 读板
使用 SPARK 读取荧光强度,激发光设置为 480 nm ,发射光为 520 nm
6. 数据处理
1) 标曲制备
2) 样品定量
载药量=破乳后读值-破乳前读值 包封率(%)=载药量/破乳后读值